Estandarización del protocolo de transformación genética de células embriogénicas de banano de la variedad ‘Williams’ (AAA) mediada por Agrobacterium tumefaciens

Resumen

Un programa de mejoramiento convencional de banano es muy dificultoso debido a los altos niveles de esterilidad, necesidad de cruzamientos interploidales, baja proporción de germinación de semillas y a un largo ciclo de cultivo. La ingeniería genética es una alternativa al mejoramiento convencional y ofrece a los fitomejoradores la oportunidad de superar las limitaciones impuestas por la esterilidad en la mayoría de los cultivares de banano. El objetivo principal de este estudio es desarrollar y estandarizar metodologías para la integración de genes en el genoma del banano en el Ecuador. La transferencia de genes fue realizada a través del co-cultivo de suspensiones de células embriogénicas del cultivar de banano ‘Williams’ con la cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105. Los plásmidos usados para la transformación fueron el pCAMBIA1301 (promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor expresando el gen reportero uidA^INT), el pESKUL1 y el pESKUL7 los cuales contienen distintos promotores de banano que expresan al gen reportero uidA^INT. El ensayo de expresión temporal en células de banano transformadas genéticamente mostró que desde 12, 26 y hasta 244 puntos azules se encontraron en las células transformadas con los plásmidos pESKUL1, pESKUL7, y el pCAMBIA1301 respectivamente. La concentración óptima del antibiótico higromicina fue probada para la selección de colonias de células transgénicas. Un protocolo estandarizado para la transformación genética de banano está siendo desarrollado, formando las bases biotecnológicas para la generación de plantas de banano resistentes a enfermedades por primera vez en el Ecuador.

Abstract

A conventional breeding strategy in banana is difficult due to the high level of sterility, need of interploidy crosses, poor seed germination rate and long life cycle. Genetic engineering is an alternative to conventional breeding and offers plant breeders an opportunity to overcome the constraints imposed by sterility of most banana cultivars. The principal objective of this study is the development and standardization of methodologies for the integration of genes into the banana genome in Ecuador.  The transfer of genes was performed through the co-cultivation of embryogenic cell suspensions of the banana cultivar ‘Williams’ with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105. The plasmids used for transformation were the pCAMBIA1301 (35S promoter driving the uidA^INT reporter gene) and the pESKUL1 and pESKUL7 which both contain different banana promoters driving the uidA^INT reporter gene. Transient gene expression assays showed up to 12, 26 and 244 blue foci in banana cells transformed with pESKUL1, pESKUL7 and pCAMBIA1301, respectively. The optimal concentration of the antibiotic hygromycin was tested for the selection of transgenic cell colonies. A standardized protocol for genetic transformation in banana is been developed, setting the basis for the generation banana plants resistant to diseases for the first time in Ecuador.